液相流動相稀釋劑的選擇

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稀釋劑的選擇

分析方法開發(fā)，如何確定稀釋劑，確保方法的適用性。

1、稀釋劑的干擾

選擇稀釋劑，首先應(yīng)考慮采用流動相體系，應(yīng)關(guān)注以下幾點(diǎn)：

稀釋劑不得干擾已知雜質(zhì)及主峰的檢測。

根據(jù)化合物的溶解特定，可適當(dāng)加入助溶劑，但最好控制在5%以內(nèi)，避免強(qiáng)溶劑效應(yīng)。

允許對照品溶液與供試品溶液配制方式有差異，但對照品所添加的助溶劑一般應(yīng)控制在2%以內(nèi)，必免溶劑效應(yīng)產(chǎn)生不良影響（如峰型、保留時間、峰響應(yīng)等與供試品有差異，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確定量）。

2、關(guān)注各雜質(zhì)及主成分的溶解度

通常有關(guān)物質(zhì)方法中主成分的濃度較大（1mg/ml~10mg/ml），若主成分在稀釋劑中的濃度接近其飽和溶解度，可能出現(xiàn)以下三種情況：

供試品提取不充分，導(dǎo)致雜質(zhì)測定結(jié)果偏低，部分未知雜質(zhì)存在無法檢出風(fēng)險。

供試品提取重現(xiàn)性差，導(dǎo)致雜質(zhì)測定結(jié)果重現(xiàn)性差。

樣品在檢測過程中有析出，存在影響雜質(zhì)準(zhǔn)確定量的風(fēng)險。

因此在進(jìn)行方法摸索時，需測定相關(guān)主成分在稀釋劑中的飽和溶解度，最好滿足飽和溶解度大于3倍的供試品濃度。

3、關(guān)注各雜質(zhì)及主成分的穩(wěn)定性

基于雜質(zhì)譜分析，配制混標(biāo)，考察混標(biāo)中各雜質(zhì)及主成分的穩(wěn)定性。

部分雜質(zhì)峰面積明顯降低，可根據(jù)該類型化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)整稀釋劑的組成或注明供試品溶液的保存條件（如避光、冷藏等）。

部分雜質(zhì)峰面積明顯升高，結(jié)合主成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)整稀釋劑的組成或注明供試品溶液的保存條件（如避光、冷藏等）。

“臨用新制"，應(yīng)注明時間，確保測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。若穩(wěn)定性小于方法運(yùn)行時間，個人認(rèn)為是不可接受的。

4、關(guān)注溶劑效應(yīng)

溶劑效應(yīng)原定義為溶劑對于反應(yīng)速率、平衡甚至反應(yīng)機(jī)理的影響。針對于分析方法，主要指的是對溶解平衡的影響，涉及稀釋劑與流動相、流動相與固定相。

4.1、稀釋劑選擇不當(dāng)引起的溶劑效應(yīng)-現(xiàn)象及原理

樣品溶液的溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動相溶劑強(qiáng)度時可能會造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象，其過程為當(dāng)溶解樣品的溶劑不同于流動相時，樣品溶劑與流動相發(fā)生混合，樣品溶劑被沖稀。如果進(jìn)樣溶劑之強(qiáng)度高于流動相，樣品在瞬間會表現(xiàn)為在較強(qiáng)溶劑中，并以較快速度通過色譜柱。色譜行為就是∶色譜峰的保留時間縮短。`當(dāng)進(jìn)樣溶劑與流動相混合時，一部分分子會先與流動相混合，致使這些分子通過色譜柱的速度發(fā)生變化，使峰形扭曲，發(fā)生變形。

4.2、稀釋劑選擇不當(dāng)引起的溶劑效應(yīng)-如何判定

通過HPLC儀器比對一下兩個劈叉峰的紫外吸收波譜，第一就是通過HPLC儀器比對一下兩個劈叉峰的紫外吸收波譜，看看他們是否能*一樣的μV特征吸收，第二將進(jìn)樣體積調(diào)節(jié)到0.1μl看看，峰是否好轉(zhuǎn)，如果滿足上面兩個條件幾乎就可以肯定是100%的溶劑效應(yīng)。

4.3、稀釋劑選擇不當(dāng)引起的溶劑效應(yīng)-如何避免降低稀釋的強(qiáng)度（如增加水相比例、調(diào)整pH等）或更換稀釋劑為流動相，2、在保證檢測靈敏度的前提下，降低進(jìn)樣量。3、增加峰形前延抑制器，峰形前延抑制器的設(shè)計原理是，在色譜柱前端引入一個大小合適的空腔，使樣品到達(dá)色譜前被存留于空腔內(nèi)的流動相（色譜柱平衡時流動相會充滿空腔）稀釋，使“樣品溶劑"經(jīng)稀釋后更接近流動相的組成，實現(xiàn)“樣品溶劑與流動相的組成接近"，并取代“用流動相溶解樣品"的解決方案。

4.4、基質(zhì)效應(yīng)（溶劑效應(yīng)的一個變種）

基質(zhì)效應(yīng)是指檢測系統(tǒng)檢測樣品中的分析物時，處于分析物周圍的所有非分析物質(zhì)對分析物測定的影響。產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的原因與以下四個因素有關(guān)：儀器的設(shè)計、試劑的組成成分、測試方法的原理、質(zhì)控材料的組成及處理技術(shù)等，通過回收率可以評估分析方法是否受基質(zhì)效應(yīng)的影響，一般若回收率普遍偏低、偏高或波動較大，建議考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。

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